Abstract
Leu-enkephalin and Mu Opioid Receptor 3 D Deformation when Docking
Introduction. The 3-D structure of Leu-enkephalin is known and the same is true for the Mu receptor, therefore docking programs allow to study this intimate relationship when they interact. The main purpose of this study was to determine which parts of the enkephalin fit the active zone of the receptor and the amino acids which configure the active cavity.
Methods. Spartan-1.0.2 and Arguslab-4.0.1 molecular modeling software were used in order to determine the Leu-enkephalin basal equilibrium energy starting from its beta strand configuration form. Through an MMFF procedure followed by an semiempirical AM1 method having the enkephalin with a positive charge and a negative one at each end. Tyr 148 from the receptor was used as starting point for the docking procedure. The program oriented and fit the enkephalin in a 3D grid measuring x = 14,5 Å, y = 17,8 Å y z = 18,1 Å and 0,4 Å between each point.
Results. Each amino acid of that ligand were coupled to 19 residues of the receptor. It is important to remark that the conformation of Leu-enkephalin at the lowest energy, 66.2 kcal/mol, is different to the one observed in the ligand-receptor interaction -12.6 kcal/mol.
Conclusions. Differences observed in the neuropeptide conformations may be due to bending originated by the two opposite charges located at both terminal residues. When Leu-enkephalin is coupled to the receptor, shows a slightly more extended configuration and is located at the lower zone of the cavity likewise some antagonists do.
Resumen
Introducción
Se conocen las estructuras de la Leu-encefalina y receptor Mu y los programas computarizados permiten estudiar esta relación íntima cuando se acoplan. El objetivo principal de este estudio fue determinar cuales partes de la encefalina se acoplan con la zona activa del receptor. También fue importante determinar cuales aminoácidos configuran la cavidad activa del receptor.
Métodos
Fue utilizado el software Spartan-1.0.2 y Arguslab-4.0.1 de modelaje molecular para determinar la energía basal de equilibrio para la Leu-encefalina a partir de su configuración de hebra beta inicial. A través de un procedimiento MMFF seguido del método semiempírico AM1 teniendo la encefalina una carga positiva y una negativa en cada extremo. Fue utilizada la Tir 148 del receptor como sitio inicial del procedimiento de acoplamiento. El programa orientó y acopló la Leu-encefalina en una zona de rejilla 3D con medidas de x=14.5 Å, y=14.5 Å y z= 18.1 Å de 0.4 Å entre cada punto.
Resultados
Todos los aminoácidos del ligando fueron acoplados con el receptor. Es importante señalar que la conformación de mínima energía de la Leu-encefalina, con 66.2 kcal/mol, es diferente de la observada en la interacción ligando-receptor de -13.6 kcal/mol.Se observó la interacción de los 5 aminoácidos del ligando con 19 del receptor Mu.
Conclusiones
Las diferencias observadas en las conformaciones del neuropéptido pueden ser debido al doblez originado por las dos cargas opuestas en sus extremos. Por otro lado, cuando laLeu-encefalina esta acoplada al receptor, tiene una configuración ligeramente más extendida y se ubica en la porción baja de la cavidad del receptor igual que algunos antagonistas.
Introducción
El avance de los programas computarizados actuales permite visualizar las estructuras tridimensionales de los opioides y la interacción ligando-receptor (L-R), y calcular las distancias interatómicas de esta unión molecular íntima. Estos adelantos técnicos pueden ahora emplearse para estudiar el acoplamiento de ambas moléculas y la conformación activa del ligando.
Hasta la fecha no existe información acerca de las estructuras de los receptores opioides con estudios de cristalografía de rayos X, razón por la cual los modelos teóricos son una herramienta muy importante para estudiar y analizar la relación estructura-función. El estudio continuo de dichas relaciones permite desarrollar modelos útiles más realistas de los complejos L-R para elucidar los determinantes moleculares de la afinidad del ligando y su selectividad, para comprender el mecanismo de la función de agonistas y antagonistas (1).
La investigación acerca de los receptores opioides ha llevado al conocimiento amplio de los mecanismos que se ponen en marcha por la unión L-R involucrada en la analgesia. Como resultado de esto, se estima que los opioides actúan modificando las permeabilidades iónicas como la conductancia al potasio de las membranas nerviosas, lo cual a su vez da como resultado la hiperpolarización y la depresión de la excitabilidad en el sistema neuronal, y por consiguiente alteraciones en los sistemas centrales de neurotransmisores principalmente colinérgicos, adrenérgicos, serotoninérgicos y dopaminérgicos, etc. (2,3).
Los agentes que actúan a nivel de los receptores opioides Mu han sido utilizados para aliviar el dolor como analgésicos, lo cual los convierte en medicamentos muy importantes para mejorar la calidad de vida de las personas. Sin embargo poseen una serie efectos secundarios o tóxicos importantes como son la depresión respiratoria y con el uso crónico el desarrollo de tolerancia y dependencia física.
Las propiedades tridimensionales estructurales de los ligandos opioides peptídicos están definidas en términos de los ángulos de torsión Psi, Fi, Ji y Omega entre los átomos de nitrógeno, carbono de carbonilo, carbono de metino C alfa, como son mostrados en la Figura 1 y las características funcionales de la cadena lateral hidrocarbonada en la secuencia de aminoácidos (4).
1. El ángulo psi es el arco medido entre los planos imaginarios al tomar como referencia los 4 átomos consecutivos del esqueleto peptídico entre los átomos de nitrógeno (Ni) a nitrógeno (Ni+1) de los residuos. 2. El Fi entre los grupos carbonilo (COi) y (COi+1). 3. El omega de carbono Alfa (CAlfa) a carbono Alfa (CAlfa+1). 4. El Ji del carbonilo (COi) a carbono Beta (CBeta). Cada uno de los ocho planos que forman los cuatro ángulos diedros, también denominados de torsión, son construidos con tres átomos consecutivos de la cadena y el ángulo corresponde al formado entre las dos superficies producidas al colocar el enlace de la porción media en la línea de intersección común a ambos y cada uno de los dos átomos restantes en la porción media paralela opuesta (Figura 1).
Figura 1 Ángulo de torsión Psi en un péptido. Nótese que para los demás ángulos los átomos están de acuerdo a lo explicado en el párrafo anterior.
Para los péptidos un giro Beta se caracteriza por cuatro residuos consecutivos de aminoácidos, llamados i, i+1, i+2, i+3, si la distancia entre el átomo de carbono Alfa del residuo i y el i+3 es menor de 7 Å y si los dos residuos centrales no son helicoidales o son rompedores de hélice. Cada tipo de giro es clasificado de acuerdo a los ángulos Fi y Psi. El Cuadro I muestra los valores comparativos ideales para los giros Beta tipo I y II (5). Los giros Beta tipo II´ tienen una mayor preferencia (76%) para ubicar los residuos de glicina y D-aminoácidos en la posición i+1 debido a una menor interferencia estérica (6).
Cuadro I Ángulos de torsión ideales para los péptidos con un giro Beta
| Giro Beta | Fii+1 | Psii+1 | Fii+2 | Psii+2 |
| Tipo I | -60±30 | -30±30 | -90±30 | 0±30 |
| Tipo II | -60±30 | 120±30 | 90±30 | 0±30 |
| Tipo II´ | 60±30 | -120±30 | -80±30 | 60±30 |
Únicamente está disponible la estructura cristalina del receptor de luz rodopsina, solubilizada con detergentes. Los resultados de clonación, estudios de homología y el análisis de hidropatía de las secuencias de aminoácidos indican la presencia de siete dominios transmembranales (TMDs) separados por asas intra y extracelulares, características de los GPCRs (9). Algunos modelos han sido construidos en base a los mapas EM de baja resolución de la rodopsina y unos cuantos mediante limitaciones derivadas experimentalmente para empacar juntas las siete hélices “ideales” con conformaciones arbitrarias de las cadenas laterales (10). La mayoría de los modelos considera la ubicación del sitio activo de los ligandos opioides en el interior del cúmulo de las hélices, aunque una porción muy importante del receptor se localiza en la zona externa de la membrana (11). El siguiente dibujo muestra un corte longitudinal de la secuencia del receptor Mu.
Figura 2. Representación de la secuencia de la estructura del receptor opioide Mu.
Las líneas sólidas negras representan los límites aproximados externo e interno de la membrana celular. Los círculos negros representan la ubicación de los residuos de aminoácidos conservados en la superfamilia de los receptores aminérgicos. Los círculos grises indican los residuos conservados entre los receptores Mu, Delta y Kapa. Las hélices transmembranales están designadas con números romanos. Los números arábigos designan la posición de los residuos en el dominio transmembranal. Los números de los residuos en itálicas señalan la secuencia de la cadena peptídica total, e indican el sitio y término del residuo en el presente modelo de receptor. Además se muestran los sitios de glicosilación en la porción N-inicial y palmoilación en la sección del carboxilo terminal. IL = asa intracelular; EL = asa extracelular (12).
El receptor opioide Mu es uno de los blancos biomacromoleculares de 410 residuos de aminoácidos para la acción de algunos agentes analgésicos de tipo morfinoide. Consiste en una proteína integral que transduce las señales químicas a través de la membrana celular y comparte una estructura tridimensional en común con la superfamilia de GPCRs. Posee siete dominios transmembranales (I, II, III, IV, V, VI, VII) con 25, 25, 24, 25, 25, 25 y 22 residuos de aminoácidos respectivamente, además de tres asas extracelulares EL-I, EL-II, EL-III de las cuales las dos primeras están unidas por un puente disulfuro entre los residuos Cis 140 y Cis 217, la porción de la cadena inicial que contiene el grupo amino está ubicada extracelularmente e integrada por 168 residuos. En el interior de la célula se encuentran tres asas IL-I, IL-II, IL-III y la cadena que contiene el carboxilo terminal.
Este modelo de receptor Mu presenta en su estructura superficial una gran cavidad profunda ubicada en la porción extracelular de los dominios transmembranales entre las hélices III, IV, V, VI y VII. Esta cavidad está parcialmente cubierta por las asas extracelulares.
Objetivos
Estudiar las características estructurales de la conformación activa de la Leu-encefalina al interactuar con el receptor opioide Mu y averiguar cuales son los residuos de la zona activa donde se lleva a cabo el acoplamiento del opioide.
Métodos
Se usaron los programas de modelaje molecular Spartan 1.0.2 y Arguslab 4.0.1 para calcular las geometrías de equilibrio en estado basal de la Leu-encefalina mediante un procedimiento inicial de mecánica molecular de campos de fuerza (MMFF), seguido del cálculo por el método semiempírico Austin 1 (AM1) con una carga positiva y otra negativa en sus extremos. Se seleccionó la cavidad activa del modelo de receptor opioide Mu humano, propuesto por Pogozheva (13), con los residuos involucrados en la interacción L-R. Mediante el algoritmo de ajuste y búsqueda exhaustiva Argusdock, el programa orientó y acomodó la Leu-encefalina , de forma flexible con libre giro en sus enlaces diferentes al grupo peptídico, con el receptor en 500 ensayos sucesivos. Para los cálculos eligió por omisión una zona de cálculo con dimensiones de x = 14.5 Å, y = 17.8 Å, z = 18.1 Å y una rejilla de cuadrícula tridimensional con 0.4 Å de separación (14,15). Fue calculada la diferencia de energía libre de la interacción de tipo van der Waals mediante el programa en línea de análisis energético de sistemas receptor ligando Program of Energetics Analysis of Receptor Ligand System PEARLS la cual resultó de -2.8 kcal/mol (16).
Adicionalmente, para esclarecer la función del hidroxilo de la tirosina 1, ya que puede ser aceptor o donador de puente de hidrógeno, este grupo se sustituyó por un átomo de flúor, al compuesto resultante se le denominó Leu-encefalina-F y fue acoplada con el receptor opioide Mu para observar que tan significativa es la diferencia de energía libre.
Resultados
Los grupos funcionales del posible patrón farmacofórico del receptor opioide Mu mostraron las distancias de 6.4 Å entre el hidroxilo de la tirosina y el grupo amonio; 4.2 Å entre el hidroxilo de la tirosina y el grupo aromático del residuo de la fenilalanina.
El ordenamiento puede ser representado con un mínimo de tres puntos ubicados en los centroides de los grupos hidroxilo de la tirosina y fenilalanina; y el tercero en el amino de la tirosina (17,18).
En el cuadro siguiente se muestran las características de los ángulos conformacionales.
Cuadro II. Ángulos de torsión de la Leu-encefalina .
| Aminoácido | Conformación de mínima energía | Conformación activa | ||
| | Psi o | Fi o | Psi o | Fi o |
| Tir 1 | 65.2 | - | 64.5 | - |
| Gli 2 | 106.2 | 74.9 | 3.1 | 121 |
| Gli 3 | -74.7 | 164.71 | 120.2 | 60.5 |
| Fen 4 | -66.5 | -156.1 | 114.7 | 119.6 |
| Leu 5 | 58.1 | - | 58.4 | - |
Debido a que la distancia con el carbono Alfa del residuo i+3 es mayor a 7 Å muy probablemente la conformación no es de tipo Beta ideal, situación que tampoco se presenta en muchas proteínas. La distancia entre los dos carbonos Alfa para un giro 4→1 Beta resultó de 12.9 Å y difiere de una conformación de giro Beta ideal. Sin embargo medida a partir de la glicina 2 para un 2→5 Beta se observó una distancia de 7.7 Å más cercana a la típica.
El anillo aromático de la tirosina de la Leu-encefalina presenta contacto a distancia de puente de hidrógeno 3.1 Å con las cadenas laterales de Tir 148 y Met 151 de la hélice III, además con Ile 322 de la hélice VII y las cadenas de Fen 237 y Trp 293, estos dos últimos ubicados a mayor profundidad en la cavidad al igual que las anteriores presentan una interacción de tipo hidrofóbica. La Tir 1 presenta la formación de un puente de hidrógeno a la distancia de 3.5 Ǻ entre su grupo hidroxilo y el de la Tir 326.
Los grupos metilo del residuo de la leucina terminal del neuropéptido muestran contactos hidrofóbicos con 4 aminoácidos del receptor opioide Mu, Asp 216, Glu 212, Ile 215 y Lis 141. La interacción con más contribución al acoplamiento en este grupo es de tipo hidrofóbica con la cadena lateral de Ile 215.
Al acoplar Leu-encefalina-F con el receptor Mu no disminuyó notablemente la afinidad por el receptor, la diferencia de energía libre fue del mismo orden de magnitud como puede observarse en el Cuadro III.
Cuadro III. Diferencias de energía libre.
| Ligando | Blanco | Energía kcal/mol |
| Leu-encefalina | Receptor Mu | -13.6 |
| Leu-encefalina-F | Receptor Mu | -13.4 |
Las principales cadenas laterales de aminoácidos del receptor involucrados en la interacción L-R fueron Asp 147, Tir 148, Met 151, Asn 230, Trp 293, His 297, Trp 318, Ile 322 y Tir 326. La diferencia de energía libre para la interacción de van der Waals resultó de -2.8 kcal/mol.
En el Cuadro IV son presentados los residuos del receptor opioide Mu que interactúan con el ligando.
Cuadro IV Aminoácidos del receptor Mu que interactúan con la Leu-encefalina .
| Aminoácido | H-II | H-III | H-V | H-VI | H-VII | EL-II |
| Tir 1 | | Asp 147 Tir 148, Met 151 | Lis 233 Fen 237 | Trp 293 | Ile 322 Tir 326 | |
| Gli 2 | | | Asn 230 Lis 233 Ile 234 | Val 300 | Trp 318 | |
| Gli 3 | | Tir 148 | Asn 230 Lis 233 | | Trp 318 | |
| Fen 4 | Gln 124 | Ile 144 Asp 147 Tir 148 | | | Trp 318 Ile 322 | |
| Leu 5 | | Lis 141 | | | | Glu 212 Ile 215 Asp 216 |
Discusión
Es necesario señalar que la Leu-encefalina tiene al menos tres conformaciones distintas las cuales deben tenerse en cuenta. Primera, la obtenida de su estado cristalino por rayos X, en donde la cadena peptídica se observa totalmente extendida (19). Segunda, la correspondiente a la conformación de mínima energía en estado aislado, la cual presenta un doblez en la porción media correspondiente a las glicinas 2 y 3, con la aproximación de sus extremos con las cargas opuestas correspondientes a los grupos amonio y carboxilo respectivamente. Tercera, la conformación denominada activa, resultante del acoplamiento del ligando con el receptor y diferente de las anteriores por estar aún más doblada porque se aproximan sus grupos aromáticos, observada en los resultados de este estudio.
A priori fue considerada improbable una conformación activa de acoplamiento con el receptor diferente a la de mínima energía calculada o de la estructura cristalina obtenida por cristalografía de rayos X. En el presente informe resulta evidente su diferencia mediante la observación directa de la representación de la estructura de la Leu-encefalina en su conformación activa acoplada al receptor.
En virtud de las características del software utilizado para realizar el acoplamiento, los residuos y el esqueleto hidrocarbonado del receptor permanecen fijos. La única molécula que sufre cambios conformacionales durante el procedimiento es el ligando. Sin embargo, se supone que las variaciones ocurren también en los residuos del sitio activo del receptor para transducir la señal y producir el efecto biológico.
Las características en los residuos de los aminoácidos tirosina, fenilalanina y leucina de la Leu-encefalina sugieren la conformación de tipo Beta, ya sea fuerte o inicial en la estructura secundaria del opioide. Además, la presencia de la secuencia Gli-Gli le confiere la propiedad estructural de permitir un mayor doblez debido a la ausencia de grupos voluminosos. Precisamente por la presencia intermedia en la estructura de los residuos de glicina en las posiciones 2 y 3 con características fuertes de romper la hélice Alfa (5). Además, ubicó el grupo alquilo de la Leu 5 en la parte exterior alejado de los anillos aromáticos. También se mantienen separadas espacialmente las cadenas laterales del residuo alifático de los anillos aromáticos del ligando (20). El doblez del ligando presenta una apariencia intermedia entre los giros Beta tipo II y II´. Se observa una mayor similitud al giro 2→5 Beta tipo II. Parecida al 2→5 Beta referida en resultados experimentales con micelas acuosas de dodecilsulfato de sodio estudiadas por RMN. Diferente a la obtenida utilizando disolventes orgánicos y mezclas crioprotectivas que sugieren un giro 4→1 Beta en disolución (21,22).
Estos resultados de la interacción de la Leu-encefalina con el receptor apoyan la propuesta de algunos autores al sugerir que el aminoácido Asp 147 no interactúa electrostáticamente con el grupo amino libre formando un par iónico, sino más bien con el OH de la tirosina. Tal situación tiene el respaldo experimental de los resultados de mutaciones en Asp 147 del receptor Mu opioide que no afectan notablemente la afinidad de diprenorfina o naloxona (10). Para la Leu-encefalina , a partir de nuestros resultados computacionales, se observó que la porción aromática de la tirosina del péptido opioide interactuó con los residuos conservados en la base de la cavidad ubicada entre las hélices III y V. El grupo hidroxilo de la tirosina y su amonio libre presentan interacciones con residuos de la hélice III, ubicado en el tercio externo de la porción transmembranal de la cadena helicoidal y la lisina Lis 233 de la hélice V. La distancia entre estos dos grupos del ligando, considerados puntos importantes farmacofóricos, fue de 6.4 Å en la conformación activa.
En comparación con los ligandos típicos como la morfina resultó menor a la calculada entre el grupo amino y el hidroxilo aromático de la morfina de 7.1 Å y diferente de la conformación de mínima energía calculada.
Además es importante considerar la posibilidad de un cierto grado de tolerancia estructural en la cavidad activa del receptor opioide. La cual permite la interacción con una gran variedad de agentes opioides y opiáceos con diversas conformaciones y propiedades estructurales (23,24). Informado en estudios con alcaloides pequeños, como la morfina que pueden ser acoplados con varias posiciones alternativas en la cavidad activa, donde todas las opciones proporcionan contactos entre el N+ y Asp 147 (Asp II:7) y permiten la formación de puentes de hidrógeno entre el ligando y los grupos polares (10).
Al realizar la sustitución del hidroxilo de la tirosina del ligando por un átomo de flúor y su acoplamiento con el receptor opioide Mu fue observado un cambio mínimo en la diferencia de energía libre. Resultado compatible con la idea de que existe una interacción importante con el grupo His 297 (His VI:20), probablemente de puente de hidrógeno con Nδ1. Aunque nosotros no observamos dicha interacción con His 297 sino más bien con Tir 148 (Tir III:8) como ocurre con algunos derivados de morfina sustituidos con grupos voluminosos y considerados de propiedades antagonistas, los cuales se ubican en la porción espacial “baja” de la cavidad del receptor (13).
Conclusiones
1. La Leu-encefalina al acoplarse al receptor Mu adoptó una conformación activa doblada formando un giro en el cual aproximó los grupos aromáticos de los residuos Tir 1 y Fen 4 a una distancia de 4.3 Ǻ. El pentapéptido es estructuralmente flexible y puede adoptar un gran número de conformaciones diferentes debido a sus enlaces con libre giro.
2. El ligando mostró interacción con 19 residuos del receptor: Ile 144, Asp 147, Tir 148, Met 151, Fen 152, Glu 212, Ser 214, Ile 215, Asn 230, Lis 233, Ile 234, Fen 237, Trp 293, His 297, Glu 299, Val 300, Trp 318, Ile 322, Tir 326 localizados en la mayor cavidad del receptor. Es favorecido el proceso de acoplamiento donde el hidroxilo de la Tir 1 del ligando interactúa con la Tir 148 y la formación del puente de hidrógeno con el hidroxilo de la Tir 326. Debido a la interacción con His 297 y con los residuos de aminoácidos Fen 152 y Fen 237; ubicados estos dos últimos en la zona más profunda de la cavidad, se sugiere que su comportamiento es parecido al de un antagonista Mu.
3. Los resultados apoyan la idea de la existencia de un patrón farmacofórico con cierto grado de versatilidad en la ubicación espacial de los grupos importantes amonio, aromático e hidroxilo de agonistas y antagonistas Mu al acoplarse.
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